于定国，字曼倩，东海郡郯县(今山东郯城西北)人。郯县是郯国故地，郯国是少昊的后裔建立的一个小国，后被越国吞灭; 秦汉时期为东海郡郡府所在地。郯县虽非大都通邑，却也小有名气。这方水土也曾哺育出一批名人，于定国和他父亲便是人中豪杰。
于定国的父亲，人称“于公”，起初在郯县做狱史——一个管理监狱的小吏，后来被提拔到郡里任决曹，负责审理案狱。于公执法公正，经他审判的案子，罪犯死而无憾。在他审理的案件中，最为有名的是“东海孝妇”一案。
这位女子是东海郡人，极为孝顺，人称“东海孝妇”，其姓氏却被人遗忘了。孝妇年轻守寡，膝下无子亦无女，与婆婆同居，很是孝敬。婆婆念她年轻，劝她再嫁，她总是不肯，要侍养婆婆，养老送终。婆婆对邻人说： “儿媳为了侍养我不改嫁， 她还年轻， 我老了， 还要牵累她， 如何是好! ”邻人亦无良策，唯有陪着她叹息。为了儿媳的幸福，婆婆觉得只有尽快结束自己的性命。几天后，趁儿媳不在家，她上吊自尽了。
婆婆有个女儿，已经出嫁，闻悉噩耗，遂断定是孝妇下的毒手，向官府控告。官府逮捕孝妇，严刑拷问，孝妇屈打成招。
案卷送到于公处，于公断定： 孝妇侍养婆婆已10多年，以孝顺著称，决不会杀害婆婆。然而，郡守却认定孝妇是凶手，要判她死刑，于公力争，太守不听。于公抱着判决书，放声大哭，辞官而去。
孝妇被押赴刑场处死了。
郡中大旱三年，草木枯死。
太守任满调走，新太守上任，占卜郡中何以会有如此大旱，于公闻讯，前去郡府，对新太守说： “孝妇死的冤枉，大旱的根源大概在乎此。”于是，新太守杀牛亲祭孝妇，旌表其墓。据说，天立下大雨，草木复苏。
东海郡由此更加敬重于公， 为他立生祠， 号曰“于公祠”。
后来，这事屡加演义，东海孝妇的故事遂成为中国民间文学中的悲壮的一幕。于公成了妇孺皆知的“青天老爷”。
于定国少时便师从父亲诵习律令，于公成了他的启蒙老师。于定国聪睿，颇得父亲真传。像父亲一样，他入仕后也做了狱史、决曹，他也像父亲一样执法公允。于氏父子名闻天下。不久，于定国被擢为国家最高执法官廷尉的属吏。于定国离开了东海郡，来到京师长安(今陕西西安)。
初至京师为官，于定国便显示出非凡的才干，在审理一起谋反案中，他的才智大令同行和上司佩服，被提升为侍御史。侍御史隶属御史中丞，受理公卿奏事，举劾非法，职权颇重。不久，又升任御史中丞，这是一个外督十三州刺史，内领十五员侍御史的高级监察官。
刚刚上任，朝廷便发生重大变故： 21岁的当朝天子昭帝驾崩。昭帝无子，辅政大臣霍光拥立昭帝的侄儿、昌邑王刘贺为帝。这刘贺乃昏庸荒淫之辈，初登帝位还有所顾忌，装模作样，不久便原形毕露，荒淫起来。
作为一名高级监察官，一个臣子，于定国既要督察百官，亦须谏言皇上的过失。他上书直谏，刘贺视若罔闻。
执政大臣霍光等人不能容忍昏君在上，奏明上官皇太后，废黜刘贺，另立武帝曾孙刘询为帝，是为宣帝。
宣帝登极，对凡是劝谏过刘贺者，皆加官晋级，于定国升为光禄大夫、平尚书事。光禄大夫秩比二千石，评议朝政得失; 尚书乃皇帝的文书官，平尚书事即平定、管理尚书事务。自汉昭帝以来，大司马大将军领尚书事，成为最高决策机构，参与尚书事务者，权力极大。时任大司马大将军领尚书事者，乃霍光。宣帝是他拥立的，他的名份是臣子，职权却凌驾于宣帝之上。于定国精明强干，颇得霍光信用。
第四年上，即本始三年(前71)，于定国被擢为职司上林苑等事务的水衡都尉。后又被破格擢为廷尉。
于定国成为九卿之一。他自幼诵习律令，通晓法律，擅长审理案狱，但他不懂儒经，此为一大缺憾。自汉武帝以来，儒学被定为一尊，儒经成为治国方针。为宦之人皆需通晓儒经。于定国深知自己缺少儒学修养，遂拜师诵习《春秋》，他手执经卷，北面备弟子礼，谦虚问学。凡是儒士，他皆敬重，即使是贫寒的儒生，从他身边走过，他也下车施礼。儒、法双修，使他名声更振，朝野上下，无不称道。
于定国审判案狱，谨慎小心; 务求公允。若案子定罪可轻可重，则从轻发落; 对于鳏寡孤独，尤加宽容。经他审理的案子，犯人没有冤言。他被公认为汉开国以来的第二位最杰出的廷尉——第一位是张释之。
于定国做了整整18年廷尉。有汉一代，任职如此之久者，绝无仅有。
甘露二年(前52)五月，于定国被擢为三公之一的御史大夫。
第二年三月，丞相黄霸病死。五月，于定国被任命为丞相，封西平侯。
这时霍光早已死去，霍氏势力已被铲除，亲政的宣帝对于定国颇为依重。宣帝治国，推重霸王道杂之，即兼用儒、法，德、刑并重。而于定国儒、法双修，正合宣帝口味。
任相第三年上，宣帝驾崩，皇太子刘奭即位，是为元帝。
于定国乃前朝重臣，元帝颇为敬重。
此时，大司马为史高，御史大夫乃陈万年。史高是以外戚身份任大司马的，没多少才干。御史大夫乃丞相副贰，而陈万年又极为谦让，不与人争。朝政大事决于于定国，陈万年仅随声附和几句而已。
这种局面维持了整整八个春秋。
第九年，陈万年病死，长信少府贡禹出任御史大夫。这位来自琅琊(郡治东武，今山东诸城)的著名儒士精明超人，尽管他位次于定国，却不肯随声附和，常常与于定国论辩。于定国是位老臣，为政经验丰富，故虽然贡禹持有异议，但元帝往往采纳于定国的建议。
元帝聪明多才艺，然优柔寡断，非治国之明君。大汉帝国各种潜伏的危机到他君临天下时暴露出来，加上中原一带自然灾害不断，黎民纷纷破产，成群结队拥入长安及其附近地区，扰乱了关中的统治秩序。元帝惶恐，三番五次召见于定国，责问他身为丞相，何以竟使天下如此。于定国谢罪，与皇上商定了一些救急措施：
第一，皇上减损用度，节省资财赈济灾民。
第二，赐天下孝悌、力田和鳏寡孤独布帛。
第三，废止盐铁官营，让利于民。
第四，约法省禁，废止律令70余条。
这些措施对缓解危机多少起了点作用，但极为有限。危机的根源是官吏贪残，豪强地主兼并农田，而救急措施没有触动官吏、地主的利益，故危机是不可能缓解的。
实际上，元帝虽然一再减膳、省乐，一副救世君主的样子，不过装模作样而已。就在饥民遍地的岁月，他兴师动众，去河东祭祀后土神，劳民伤财，所费不赀。
然而，他不反躬自省，却把危机迟迟不能缓解的罪责推到于定国头上，屡屡降诏责斥。于定国实在无妙方良策，只好托言有病上疏辞职。元帝见状，下诏宽慰，要他留任。于定国以年老体弱有病为由力辞，元帝遂加诏准，赐他四匹马拉的舒适豪华的车子一辆，黄金60斤，让他回长安的府第休养。
这是永光元年(前43)十一月的事。
于定国回到了府第，安度晚年，数岁后病死，享年70岁，谥为“安侯”。
于定国嗜酒豪饮，据说能连喝数石而不醉。汉时一石约合今90多斤。一个人再能喝也喝不了数石，显然有些夸张。但于定国的酒量闻名天下，却诚非虚也。
于定国的儿子于永颇有父风，嗜酒好饮，但不奉法度。直到30岁上，才幡然悔过，折节修行，累官至三公之一的御史大夫，尚宣帝女儿馆陶长公主刘施。成帝欲拜他为相，于永却不幸病逝。
于永的儿子于恬，却是个不肖之徒，浪荡无行。